• 分類：應(yīng)用案例
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• 發(fā)布時間：2022-11-03 16:25
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【概要描述】多光子生物成像解決方案 - 自1663年，羅伯特.胡克在實驗室中觀測到了細(xì)胞壁，并命名為【cellua】開始，人類微觀生物世界的大門就此打開。自那之后經(jīng)歷了3個多世紀(jì)，從生物切片顯微觀測為開端，人類對于微觀生物的研究從未停止。 上世紀(jì)90年末開始，隨著飛秒激光技術(shù)的提出，到如今的走向成熟，更加尖端且成熟的生物觀測儀器繼續(xù)為人類生物微觀世界的研究貢獻出自己的力量，其中能夠探測活體神經(jīng)元的，便是我們接下來的主角——【雙光子熒光顯微鏡】 01.什么是雙光子熒光顯微鏡 雙光子激發(fā)熒光這個理論是1931年由瑪麗亞·格佩特-梅耶在她的博士論文中闡述了原子的雙光子吸收的可能性，但是將她的理論研究轉(zhuǎn)化成實驗室的可觀測現(xiàn)象進行證實時，已經(jīng)是1960年激光誕生之后的事情了。 ? 在雙光子顯微鏡出現(xiàn)之前，主流的觀測應(yīng)用是共聚焦顯微鏡，它的主要原理是采用點光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路反射到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接反射至探測器。屬于通過聚焦光來進行單光子熒光。優(yōu)點是觀測速度快，缺點是觀察深度淺、清晰度差。 ? 而雙光子顯微鏡，是通過瞬間對熒光蛋白射入高密度光子，熒光分子可以同時吸收 2 個光子，并產(chǎn)生類似倍頻效應(yīng)的特性，實現(xiàn)在觀測深度和呈像清晰度上質(zhì)的突破。 ? 共聚焦顯微鏡與雙光子顯微鏡的觀測深度對比 ? 02.與激光的有機結(jié)合 雙光子熒光顯微鏡是共聚焦顯微鏡與飛秒激光結(jié)合的產(chǎn)物。它利用飛秒激光器照射，在樣本的表面或內(nèi)部聚焦，發(fā)揮飛秒脈沖激光器由于脈寬窄、峰值功率高的特性, 使熒光蛋白發(fā)生雙光子激發(fā)，并發(fā)生熒光信號。 ? 當(dāng)然，不同物質(zhì)的雙光子激發(fā)光譜也不同，這直接影響了熒光蛋白對不同波長激發(fā)光的吸收效率。類比地，如果一種熒光蛋白對于一種飛秒激光所在波段的雙光子吸收效率過低，也會難以被激發(fā)，從而難以實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)的雙光子熒光成像效果。反之，激光器所在波長對其激發(fā)效率越高，則成像效果越好，主要體現(xiàn)在清晰度等方面，這樣才能讓研究人員更加直觀的觀測和還原樣品的形貌。 ? 不同熒光蛋白材料對光譜的吸收率也有所不同 ? 雙光子激發(fā)熒光顯微成像對EGFP-2P熒光蛋白的效果對比A．920nm波段B．780nm波段 從上圖中可以看出，對不同波段均有反應(yīng)的熒光蛋白，在吸收率較高的波段成像效果更加優(yōu)秀。03.實現(xiàn)途徑為實現(xiàn)這種應(yīng)用，中山銦尼鐳斯科技有限公司于2012年開始，進行了飛秒激光光源的研發(fā)。經(jīng)過了長達10年的積累，完成了該波段激光器的全部工程化工作。 Nd-930 ? 產(chǎn)品說明： 該激光器基于光纖式種子源與放大級，能夠穩(wěn)定輸出中心波長為930 nm ± 5 nm的飛秒 (fs) 級激光脈沖序列，平均功率 > 1 W，脈沖寬度 < 350 fs，重復(fù)頻率40 - 80 MHz（可定制），M2 ≤ 1.3。特別適用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的雙光子成像應(yīng)用。 ?